Dado que la composición de iones en el citosol de las células determina muchas funciones cruciales, como la excitabilidad de las neuronas, la transcripción de genes y el movimiento celular, solo por nombrar algunas, la regulación de los iones intracelulares en términos espaciales y temporales es de gran interés para la vida. investigación científica. La formación de imágenes de iones (calcio, cloruro, magnesio) es un método común que utiliza colorantes fluorescentes o proteínas especialmente diseñadas para cambiar su comportamiento de emisión tras la unión del calcio. Esto permite a los investigadores observar cambios dinámicos en las concentraciones de iones de las células. Además, es posible obtener imágenes de los niveles de pH o voltaje intracelular con tintes fluorescentes especiales. Una técnica especial para detectar cambios en los niveles de iones, niveles de pH o voltaje es la formación de imágenes radiométricas. Esto se refiere a un grupo de métodos que permiten una determinación exacta de los cambios en las células, por ejemplo.

La fluorescencia de reflexión interna total o TIRF es una técnica especial que se utiliza para observar eventos que se encuentran en o cerca de la membrana plasmática de una célula. Mediante el uso de un campo evanescente para la excitación de fluorocromos que solo penetra 60-250 nm en la célula, la microscopía TIRF proporciona una resolución z inigualable que permite obtener imágenes de eventos que ocurren en la membrana plasmática o cerca de ella, por ejemplo, el transporte de moléculas a la membrana plasmática . TIRF evita el problema de verse abrumado por las señales de fluorescencia de moléculas más profundas dentro de la célula.

Figura 1: A) Imagen general con epifluorescencia. B) Imagen general con TIRF , la sección etiquetada se muestra en C. C) Secuencia de tiempo de una sección con TIRF (el tiempo se da en segundos). Una vesícula de galectina-3 (marcada con YFP) cerca de la membrana (flecha) se transporta primero a lo largo de un filamento de actina (de abajo hacia arriba), cambia a otro filamento (88 s), se mueve hacia la izquierda (109 s), se transportado nuevamente hacia la derecha, cambia nuevamente a otro filamento y luego es transportado hacia arriba (246 s). YFP: rojo; CFP: verde; escala de imágenes generales: 20 µm; espesor de sección: 6 µm; profundidad de penetración TIRF : 110 nm. Cortesía de Ralf Jacob, Universidad de Marburg, Alemania.

La transferencia de energía de resonancia de Förster o FRET pertenece a un grupo de técnicas de fotomanipulación que le permiten interactuar con el evento observado en la muestra mediante el uso de la luz.

FRET es una herramienta útil para cuantificar la dinámica molecular, como las interacciones proteína-proteína, las interacciones proteína-ADN y los cambios conformacionales de las proteínas. Las imágenes FRET normalmente usan derivados de GFP(proteínas fluorescentes verdes), en particular CFP e YFP (proteína fluorescente cian y amarilla, respectivamente), que se unen a proteínas de interés mediante métodos de biología molecular. Luego, la molécula de CFP se excita con luz fluorescente. Tan pronto como las proteínas de interés estén en estrecha proximidad espacial (<20 nm), la CFP actuará como donante y transferirá la energía que se emite en forma de luz a la YFP, que actúa como aceptor. El investigador observará un cambio de la fluorescencia azul emitida por el CFP a la fluorescencia amarilla emitida por el YFP. En el caso de BRET (transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia), el donante es una molécula bioluminiscente (por ejemplo, derivados de luciferasa) que actúa como donante y, como en FRET , un derivado de GFP actúa como aceptor.

Figura 2: Imagen confocal de células vivas de Arabidopsis; retículo endoplasmático: GFP marcado en verde, cloroplastos autofluorescentes en rojo y transmisión en azul. Usando una imagen de este tipo, por ejemplo, FRET o FRAP , se puede realizar el análisis.

La recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo ( FRAP ) es otra técnica de fotomanipulación que se usa a menudo para controlar el tráfico de proteínas o vesículas. FRAP utiliza una proteína fluorescente (generalmente GFP) unido a una proteína de interés, es decir, una proteína cuyo movimiento se va a controlar. Por lo general, toda la célula es inicialmente fluorescente ya que la proteína puede ser abundante en toda la célula. Luego, una determinada región de la célula, a menudo con estructuras celulares como axones o dendritas en las células neuronales, se expone a altas intensidades de luz para eliminar (blanquear) la fluorescencia en esa región en particular. A medida que la proteína de interés se mueve, aparecerá en la región blanqueada a cierta velocidad, que se puede rastrear con la señal fluorescente en recuperación de esta región, lo que brinda a los investigadores una idea de la dinámica del transporte intracelular.

La fotoactivación, un método desarrollado recientemente, marca de forma selectiva áreas de interés dentro de una célula u organismo mediante el uso de colorantes especialmente diseñados, como la proteína fluorescente verde fotoactivada (paGFP) o Kaede. Estos tintes solo muestran una fluorescencia significativa después de la iluminación con luz de una longitud de onda específica. Estos tintes también se pueden fusionar con una proteína de interés para estudiar su expresión o dinámica de transporte mediante FRAP o seguimiento de partículas.

Las imágenes de células vivas son una herramienta indispensable en la investigación de las ciencias de la vida que permite la visualización de las células en un estado lo más cercano posible al in vivo. La adquisición de imágenes de células vivas le permite comprender completamente y abordar sus preguntas de investigación sobre el movimiento celular, el crecimiento y los procesos dinámicos.

Se agradece la información de técnicas en células vivas a Leica:

https://www.leica-microsystems.com/science-lab/fluorescence-live-cell-imaging-techniques/